Главная » 2014 » Июнь » 20 » Скачать Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций. Гришина, бесплатно
3:12 AM
Скачать Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций. Гришина, бесплатно
Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций
Диссертация
Автор: Гришина, Виктория Валерьевна
Название: Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций
Справка: Гришина, Виктория Валерьевна. Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций : диссертация кандидата медицинских наук : 14.00.14 , 112 c. :
Объем: 112 стр.
Информация: ,
Содержание:
Список сокращений '
Введение :
Глава 1 Обзор литературы;
11 Источники стволовых клеток, используемых для трансплантации,'
12 История трансплантаций ПК
ИЗ Преимущества и недостатки ПК
14 Сбор пуповинной крови
141 Обследование беременной ?
142 Методы забора ПК
151 Краткосрочное хранение ПК? ?
16 Предварительное обследование ПК
17 Оценка потенциала стволовых клеток Сравнительная характеристика с КМ и ПСК
171 Клеточность;
172 CD34+^
173 КОЕ-ГМ
18 Выделение стволовых клеток из ПК
1:9 Криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови ;
191 Криопротекторы? '
192 Замораживание
193 Долгосрочное хранение
194 Размораживание•
110 Архивирование биоматериала
Глава П Объекты, материалы и методы
21 Объект и материалы исследования
2:2 Методика сбора пуповинной крови
2:3 Методика фракционирования пуповинной крови
ТА Методика крноконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови?
25 Лабораторные методы исследования
251 Определение содержания форменных элементов:
252 Подсчет лейкоцитарной формулы
253 Определение клеток с имунофенотипом CD34+
254 Определение гранулоцитарно-моноцитарных клеток-предшественниц^• ;
255 Определение жизнеспособности клеток
256 Определение бактериального загрязнения кровна
257 Выявление ДНК возбудителей Neisseria gonorrhoeae, Toxplasma gondii и цитомегаловируса;
258 Определение наличия антител к ВИЧ-1/2,, HbsAg, антител к вирусу гепатита С
259 Определение наличия антител к бледной трепонеме (серодиагностика сифилиса)
2510 Компьютерная морфометрия форменных элементов ПК
26 Измерение температуры биоматериала н криобокса
27 Мётодшса создания компьютерной базы данных для архивирования пуповинной крови, находящейся на длительном хранеш<и
28; Методы статистической обработки результатов
Глава III Результаты исследования и их обсуждение
31 Сбор пуповинной крови
32 Краткосрочное хранение пуповинной крови
33 Выделение клеточной фракции ?
34 Криоконсервнрование пуповинной крови
35 Динамика показателей ПК в процессе её сбора, сепарации и криоконсервации
36 Архивирование пуновинной крови
Глава IV Заключение
Выводы
Введение:
Актуальность работы.
В последние годы для лечения злокачественных новообразований (как солидных, так и гематологических) и ряда неопухолевых заболеваний (наследственные болезни, болезни обмена, системные заболевания соединительной ткани) стали достаточно широко использоваться сверхинтенсивные курсы химиотерапии (высокодозная химиотерапия) с последующим восстановлением кроветворения трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток.
Гемопоэтические клетки для трансплантации могут быть получены у однояйцового HLA-идентичного близнеца (сингенная трансплантация), родственного или неродственного донора, совместимого по основным антигенам HLA (аллогенная трансплантация) или у самого больного (аутологичная трансплантация). До недавнего времени во всех вышеперечисленных случаях гемопоэтические клетки получали из костного мозга и/или периферической крови [14], однако данные методики не лишены существенных недостатков. В связи с риском развития смертельно опасной реакции «трансплантат против хозяина при проведении аллогенной трансплантации необходимо наличие HLA-совместимого донора. В этом отношении идеальными донорами гемопоэтических стволовых клеток являются HLA-идентичные доноры-близнецы. Однако такая возможность имеется лишь у единичных больных и в данном случае отсутствует реакция «трансплантат против опухоли». Совместимого по основным локусам HLA-системы родственного донора имеют лишь 30-40% больных, а шанс на подбор неродственного донора еще более ограничен. Использование аутологичных стволовых клеток, полученных в период уже существующей болезни, несет в себе потенциальную опасность - возможную контаминацию опухолевыми клетками при ретрансфузии. Кроме того, получение гемопоэтических клеток из костного мозга и из периферической крови требует проведения инвазивных манипуляции и введение лекарственных веществ, представляющих потенциальную опасность для жизни и здоровья донора.
Альтернативным источником репопулирующих гемопоэтических клеток пригодным для трансплантации является пуповинная кровь. Использование пуповинной крови имеет целый ряд преимуществ перед другими источниками кроветворных клеток:
1 .Отсутствует риск для здоровья матери и ребенка (донора).
2. Увеличивается возможность использования не полностью совместимых по HLА-системе (от 1 до 3 антигенов) трансплантатов[40,47].
3.Увеличивается вероятность нахождения редких HLA-типов трансплантатов.
4. Значительно снижается риск передачи некоторых латентных инфекций, передаваемых трансмиссивным путем [71].
5. Появляется относительно недорогая форма биологического страхования жизни в связи с возможностью использования клеток пуповинной крови в качестве аутологичного трансплантата.
В тоже время по принятым стандартам для адекватного восстановления гемопоэза требуется определенное количество гемопоэтических клеток на килограмм веса реципиента. В связи с этим принципиальным недостатком пуповинной крови можно считать малое абсолютное количество гемопоэтических клеток и невозможность повторного получения их от того же донора. По данным литературы из 2100 заготовленных образцов пуповинной крови для реципиентов с массой тела 50-70 кг. потенциальными трансплантатами могли считаться лишь 25%, для реципиентов с массой тела до 35 кг. - 67% и лишь для больных с массой тела ниже 10кг. —100% [49].
В связи с выше сказанным основной задачей при заготовке пуповинной крови является обеспечение наименьшей потери стволовых клеток. В настоящее время в мире существует несколько методик получения, фракционирования и криоконсервирования пуповинной крови. Актуальностью данного исследования является поиск методов фракционирования, концентрации и состава криопротектора, а так же режима замораживания, способных обеспечить наименьшие потери клеточной массы и её функциональной активности.
Цель исследования.
Разработать единый технологический процесс, включающий в себя сбор, фракционирование, тестирование; криоконсервирование и архивирование пуповинной крови, подлежащей длительному хранению при ультранизких температурах, способный обеспечить минимальные потери клеточной массы, используя опыт криоконсервации костного мозга и периферических стволовых клеток в банке криоконсервированных биоматериалов ГУ РОНЦ им. Н.Н. БлохинаРАМН.
Задачи исследования.
1. Изучить закрытый способ сбора пуповинной крови.
2. Модифицировать методику закрытого способа сбора пуповинной крови в соответствии с условиями и средствами отечественного здравоохранения:
3. Разработать оптимальную методику фракционирования пуповинной крови:
4. Определить сроки и условия хранения ПК до момента ее обработки.
5. Подобрать оптимальный состав и концентрацию криопротектора.
6. Провести оценку потерь стволовых клеток на этапах фракционирования и криоконсервирования ПК.
7. Разработать оптимальную методику замораживания.
8. Создать компьютерную базу данных для исключения ошибок при архивировании хранящегося биоматериала.
Научная новизна.
Модифицирован закрытый способ сбора пуповинной крови в соответствии с условиями и средствами отечественного здравоохранения. Впервые применены: метод фракционирования ПК в полиглюкине, использование низких концентраций диметилсульфоксида в качестве криопротектора в сочетании с полиглюкином, оригинальная методика замораживания, а также произведена тщательная оценка количественного и качественного состава пуповинной крови на всех этапах обработки биоматериала: Впервые создана компьютерная база данных для архивирования пуповинной крови.
Практическая значимость работы.
Разработан легко осуществимый и эффективный единый технологический процесс заготовки пуповинной крови, подлежащей длительному хранению при ультранизких температурах, не требующий дорогостоящего оборудования и особой1 подготовки медицинского персонала. Модифицирована методика закрытого способа забора пуповинной крови. Разработаны методы сепарации и криоконсервирования пуповинной крови с использованием общедоступных реактивов и оборудования, обладающих высокой эффективностью и небольшой себестоимостью.
Проведенные исследования позволили оценить необходимость использования различных лабораторных исследований на всех этапах криоконсервания пуповинной крови. Все это в комплексе с компьютерной базой данных позволило создать банк пуповинной крови (300 образцов). Получено решение о выдаче патента на изобретение «Способ криоконсервирования пуповинной крови» (заявка № 2004116209).