Главная » 2014 » Июль » 18 » Скачать Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин бесплатно
10:00 PM
Скачать Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин бесплатно
Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином
Диссертация
Автор: Грачева, Мария Андреевна
Название: Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином
Справка: Грачева, Мария Андреевна. Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином : диссертация кандидата химических наук : 03.00.23 / Грачева Мария Андреевна; [Место защиты: Моск. гос. акад. тонкой хим. технологии им. М.В. Ломоносова] Москва, 2008 152 c. : 61 08-2/135
Объем: 152 стр.
Информация: Москва, 2008
Содержание:
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 Обзор литературы
11 Характеристика рицина
111 Рибосом-инактивирующие лектины
112 Строение рицина и его действие на эукариотические клетки
113 Биосинтез рицина
114 Транспорт рицина в клетках млекопитающих
115 Действие А-субъединицы рицина на рибосомы
116 Иммунологические свойства рицина
12 Профилактика излечение отравлений рицином
121 Воздействие рицина на организм животных
122 Разработка антидотов против рицина
123 Разработка вакцин против отравлений рицином
124 Разработка тест-систем для обнаружения рицина
13 Применение субъединиц рицина в медицине
131 Иммунотоксины
132 Адьюванты для создания вакцин47
14 Использование технологии создания химерных белков для получения рекомбинантных антигенов
141 Аффинные домены и белки-носители
142 Применение целлюлозы, как иммуносорбента
ГЛАВА 2 Экспериментальная часть
21 Материалы и реактивы
211 Плазмидные векторы и олигонуклеотиды
212 Бактериальные штаммы и среды
213 Ферменты
214 Сорбенты
215 Другие реактивы
216 Буферные растворы
217 Лабораторные животные
218 Оборудованиел
22 Основные методики
221 Выделение ДНК клещевины7Г
222 Полимеразная цепная реакция
223 Химико-ферментативный синтез
224 Сайт-специфический мутагенез
225 Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами
226 Фракционированиефрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле
227 Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля
228 Лигирование фрагментов ДНК
229 Выделение и очистка аналитического количества плазмидной ДНК
2210 Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК
2211 Определение нуклеотидных последовательностей плазмидных ДНК76 2212 Подготовка компетентных клеток Е coli для трансформации плазмидной
ДНК электропорацией
2213 Трансформация клеток Е coli
2214 Электрофорез белков в ПААГ-ДСН
2215 Выращивание штамма-продуцента и индукция синтеза рекомбинантных белков
2216 Определение растворимости белков
2217 Определение периплазматической локализации белков
2218 Выделение и очистка белков, содержащих ШБе-аффинную метку
2219 Выделение и очистка белков, содержащих CBD
2220 Иммунизация кроликов
2221 Непрямой ИФА
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение
31 Получение рекомбинантных аутентичных RTA и RTB
311 Клонирование нуклеотидной последовательности аутентичной RTA
312 Клонирование нуклеотидной последовательности аутентичной RTB
313 Экспрессия рекомбинантных генов аутентичных RTA и RTB в клетках Е coli М15
32 Получение рекомбинантной мутантной RTA
321 Клонирование нуклеотиднойпоследовательности мутантной RTA96'
322 Экспрессия рекомбинантного гена мутантной RTA в клетках Е coli Ml
33 Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в цитоплазме Е со Ii
331 Клонирование гибридных генов химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD
332 Экспрессия гибридных генов химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в клетках Е coli Ml 5
34 Получение химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR и исследование их иммуногенных и антигенных свойств
341 Клонирование гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR
342 Экспрессия гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR в клетках Е coli Ml 5108,
343 Выделение и очистка химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR
344 Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR
35 Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в периплазме Е coli и исследование их иммуногенных и антигенных свойств
351 Клонирование гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD и SigRTBspCBD
352 Экспрессия гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD и SigRTBspCBD в Е coli Ml 5
353 Выделение и очистка химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD
354 Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD
ВЫВОДЫ
Введение:
Актуальность проблемы. Рицин, токсин растительного происхождения из семян клещевины обыкновенной (Ricinus communis) (рис. 1), является одним из наиболее сильнодействующих токсинов [1]. Его содержание в семенах (касторовых бобах) составляет приблизительно 1-5%. С давних лет известно, что употребление всего двух бобов клещевины может оказаться смертельно опасным для человека.
Рис. 1. Клещевина обыкновенная (Ricinus communis): А. Растение с плодами. Б. Высохший плод (коробочка) и семена (касторовые бобы).
Клещевина обыкновенная представляет собой ценную сельскохозяйственную высокомасличную техническую культуру. В касторовых бобах содержится 48-55% касторового масла, которое отличается высоким содержанием трипшцеридов рицинолевой кислоты (80-85%) и используется в промышленности, медицине и косметологии. Побочным продуктом при производстве касторового масла является шрот клещевины, содержащий 37^40% питательного белка и входящий в компоненты кормов для сельскохозяйственных животных и рыб. Однако присутствие рицина в семенах клещевины осложняет производство касторового масла и шрота клещевины [2, 3, 4].
В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие заведующий лабораторией биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН, к.б.н. В.Г. Лунин.
Обычно рицин удаляют из сырья острым паром [1]. Тем не менее, такая обработка не всегда полностью инактивирует токсин, что в дальнейшем может приводить к отравлению человека и сельскохозяйственных животных. Согласно ГОСТ 18102-95 (Масло касторовое медицинское. Технические условия) и ГОСТ 17290-71 (Шрот клещевинный кормовой. Технические условия), реакция.на рицин, в продукции должна отсутствовать.
Ввиду широкого распространения клещевины как сельскохозяйственной5 культуры и простой технологии выделения, рицин является легко доступным токсином. Из-за своей высокой токсичности и доступности он привлекает внимание военных специалистов в области химического оружия, начиная с 1-ой мировой войны. Технология выделения рицина из жмыха семян клещевины не требует сложного оборудования, и поэтому рицин доступен для производства даже в странах со слаборазвитой химической промышленностью. Разработаны эффективные технологии выделения и очистки рицина до кристаллического состояния.
По оценкам экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) летальная доза неочищенного рицина в аэрозольном состоянии находится на уровне ингаляционной дозы паров зарина, а очищенного - меньше чем летальная, доза вещества VX. Ему как поражающему агенту, был присвоен шифр «W» [5]. Летальные дозы токсина зависят от способа его попадания в организм животных и от вида животных. Наиболее опасной формой рицина является' аэрозоль. Минимальная летальная ингаляционная доза рицина для человека может составлять приблизительно 0,005 мг/кг [6, 7].
В 1978 году рицином был убит болгарский телеведущий Георгий Марков. Токсин был введен журналисту в бедро "уколом" зонтика, в котором была спрятана капсула с рицином. Смерть наступила через 3 дня [8]. В 2003 и 2004 годах рицин был обнаружен в Южной Каролине (США) в почтовом отделении, обслуживающем кабинет сенатора Билла Фриста, и внутри письма, адресованного в Белый Дом (США). Рицин был обнаружен на территории США у лиц, имеющих отношение к антиправительственным группировкам и связанных с террористическими организациями [1]. В начале 2003 года британская полиция арестовала группу террористов, часть которых прошла подготовку в Чечне. В подпольной лаборатории они наладили производство рицина, а между тем, один из задержанных работал на военной базе и имел доступ к приготовлению пищи солдат [9]. Очевидно, что растительный токсин рицин представляет серьезнейшую опасность из-за возможности его использования в качестве химического оружия, в частности, в террористических целях. Он может быть применен для отравления^ воздуха в закрытых вентиляционных системах, питьевой воды и запасов-продовольствия.
Рицин - гликопротеин, белковая часть молекулы которого построена из двух субъединиц - каталитической активной А-субъединицы (RTA, Ricinus Toxin А-chain) [10] и лектиновой связывающей В-субъединицы (RTB, Ricinus Toxin Вchain), соединенных одной дисульфидной связью [11]. RTA ответственна за
•f токсические свойства рицина, а RTB за его транспорт внутрь клетки. Благодаря своей токсической активности RTA нашла применение в создании иммунотоксинов (ИТ) - конъюгатов, состоящих из токсина и антитела и обладающих направленным действием, например в противоопухолевой терапии [11], терапии ВИЧ [12], а также для подавления иммунного ответа при трансплантации органов [13].
На сегодняшний день не существует препаратов для профилактики и лечения отравления рицином, в связи с чем, чрезвычайный интерес представляет создание антидотов и вакцин, а также разработка тест-систем для экспресс-индикации рицина в окружающей среде и в организме. Наиболее перспективными представляются антидоты, полученные на основе протективных антител к рицину, а также тест-системы, основанные на иммунохимических методах. Производство подобных антидотов, тест-систем и вакцин требует получения антигенов рицина.
Работа с нативным рицином для получения его антигенов крайне сложна ввиду его высокой токсичности. Следует отметить, что RTA, изолированная от RTB, находясь вне клетки нетоксична из-за неспособности проникать в клетку без RTB [14]. RTB, сама по себе, также нетоксична [15]. Кроме того, известно, что рекомбинантные RTA и RTB сохраняют многие эпитопы нативного рицина, в том числе и протективные [16, 17]. Поэтому перспективным подходом к получению антигенов рицина является создание рекомбинантных RTA и RTB. Для разработки ИТ также возможно использование рекомбинантных RTA, но для этой цели необходимо сохранение токсичности рекомбинантых RTA и снижение их имму ногенности.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение рекомбинантных антигенов RTA и RTB и исследование их иммуногенных и антигенных свойств. Работа выполнялась в рамках комплексного проекта Федерального агентства по науке и инновациям при Министерстве образования и науки РФ по теме: «Разработка технологий, методов и средств обеспечения-системы биологической безопасности и противодействия терроризму» (шифр «БТ
00.2.001») по договору №8-JI/05 от 04.05.2005 (ГК 02.467.11.6002 от 12.04.2005).
В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие основные задачи:
1. Клонирование и экспрессия в Е. coli нуклеотидных последовательностей, кодирующих как аутентичные RTA и RTB, так и их гибриды с белками-носителями;
2. Создание эффективных штаммов-продуцентов Е. coli рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB; I
3. Разработка технологии выделения и очистки рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB;
4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств полученных белков.
Научная новизна. На основе идеологии создания многокомпонентных белков, развиваемой в исследовательских коллективах лабораторий биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, заведующим которых является к.б.н. В.Г. Лунин, были впервые спланированы и сконструированы рекомбинантные гибридные плазмидные ДНК Е. coli, позволяющие эффективно осуществлять в клетках Е. coli пггамма М15 индуцированный биосинтез химерных белков RTA-DHFR, RTB-DHFR и RTAspCBD, RTBspCBD, содержащих А- и В-субъединицы рицина и белки-носители (дигидрофолат редуктазу - DHFR и целлюлозосвязывающий домен -CBD). Впервые получены штаммы-продуценты данных белков. Разработана высокоэффективная схема выделения, очистки и иммобилизации рекомбинантных белков ЯТАзрСБШ, ЯТВврСВО на целлюлозном сорбенте, основанная на свойствах целлюлозосвязывающего домена и позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 95%. Впервые получены в препаративных количествах высокоочищенные рекомбинантные белки ЯТА-ОНГЛ, ЯТВ-ОНТЫ и ЯТАврСВВ,
• ЯТВзрСВО, способные индуцировать у кроликов выработку высокого титра специфичных к нативному рицину антител.
Практическое значение работы. Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков ЯТАэрСВО, ЯТВБрСВО и разработанный метод выделения, очистки и иммобилизации этих белков на целлюлозе, могут найти применение в области промышленной, биотехнологии при создании вакцинных препаратов для предотвращения отравлений рицином, тест-систем индикации рицина на основе иммунохимических методов, а также для получения антидотов к<, рицину на основе протективных антител. Целлюлозосвязывающий домен позволяет получать иммобилизованные препараты ЯТАзрСВО, ЯТВврСВО на целлюлозе. Белки, иммобилизованные на целлюлозном носителе, как показали данные предварительных испытаний, обладают большей стабильностью и существенно большей иммуногенностью по сравнению с раствором нативного белка [18]. Данные белки могут быть использованы для разработки нового поколения иммунологических диагностикумов, в том числе белковых биочипов, основанных на присоединении к подложке из целлюлозы данных рекомбинантных белков, а также для получения сорбентов на основе целлюлозы, для очистки противорициновых антител. В случае сохранения токсичности, связанной- с каталитической активностью ЯТА выщеплять аденин из 288 рРНК г эукариотических клеток, белок ЯТАврСВО может найти применение в качестве компонента ИТ для борьбы со злокачественными опухолями. Белок ЯТВврСВО. может бьггь использован в качестве адъюванта субъединичных генно-инженерных вакцин. 1