Главная » 2014 » Июль » 10 » Скачать Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени. Малеев, Григорий бесплатно
1:10 AM
Скачать Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени. Малеев, Григорий бесплатно
Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени
Диссертация
Автор: Малеев, Григорий Владимирович
Название: Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени
Справка: Малеев, Григорий Владимирович. Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.03 / Малеев Григорий Владимирович; [Место защиты: Ин-т биохимии и генетики Уфим. науч. центра РАН] - Черноголовка, 2009 - Количество страниц: 123 с. ил. Черноголовка, 2009 123 c. :
Объем: 123 стр.
Информация: Черноголовка, 2009
Содержание:
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Лигазная цепная реакция и методы 8 флуоресцентной детекции нуклеиновых кислот
11 Лигазная цепная реакция для детекции нуклеиновых кислот
111 Теоретические основы метода ЛЦР
112 Практическое применение ЛЦР
113 Проблемы метода ЛЦР в сравнении с методом ПЦР
12 Флуоресцентные методы детекции нуклеиновых кислот
121 Флуоресцентные методы детекции Базовые сведения
122 Методы прямого проявления
123 Системы детекции, основанные на резонансном переносе 38 энергии флуоресценции
Глава 2 Разработка систем детекции продуктов ЛЦР на основе 47 флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов
21 Олигонуклеотидные зонды на основе полициклических 48 ароматических угледоводородов
211 Пиреновый бифлуорофор с эксимерной флуоресценцией
212 Зонды на основе псевдонуклеозидного пиренсодержащего 52 флуорофора
213 FRET-системы при внедрении пирена и перилена в 59 комплементарные олигонуклеотиды
22 Олигонуклеотидные зонды на основе флуоресцеиновых и 64 родаминовых красителей
Глава 3 Новые методы детекции;ДНК и РНК при помощи ЛЦР в режиме, 65 реального времени
31 ПЦР и ЛЦР в режиме реального времени: особенности и сферы 65 использования
32 Лигазная цепная реакция в режиме реального1 времени:, основные 67 принципы •
33 ЛЦР-РВ, основанная! на- детекции» двуцепочечной ДНК при 71 помощи красителя SYBR Green I
34 Схема детекции продуктов ЛЦР, основанная на эффекте 74 эксимерной флуоресценции
35 Схема детекции продуктов ЛЦР, основанная на эффекте 77 изменения анизотропии флуоресценции
36 Схемы детекции продуктов ЛЦР, основанные на эффекте 81 резонансного переноса энергии флуоресценции
361 FRET между полициклическими ароматическими 81 флуорофорами
362 ЛЦР-РВ, основанная на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции между красителями FAM и ROX
37 Оптимизация условий ЛЦР-РВ
38 Детекция молекул РНК при помощи ЛЦР-РВ
39 Использование разработанных вариантов ЛЦР-РВ в 90 молекулярно-генетических исследованиях
Глава 4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
41 Реактивы и материалы
42 Экспериментальные методы
Введение:
Решение проблемы эффективной диагностики различных заболеваний относится к числу приоритетных задач мирового и отечественного здравоохранения. В настоящее время системы здравоохранения России и других стран испытывают насущную потребность в развитии и широком использовании систем диагностики, сочетающих высокую эффективность измерений, точность, универсальность, простоту проведения анализа, дешевизну. Приоритетные области применения подобных систем — это диагностика широкого ряда инфекционных заболеваний, по-прежнему являющихся «убийцами номер один» в мире.
Лигазная цепная реакция (ЛЦР) является одним из перспективных методов клинической диагностики, интенсивно развиваемым на практике в последние полтора десятилетия. По своей чувствительности и точности анализа ЛЦР во многих случаях продемонстрировала свое превосходство не только над классическими методами микробиологического анализа, такими как выращивание культур клеток, иммунохимический анализ, но также и над современными вариантами ПЦР-диагностики (ПЦР - полимеразная цепная реакция).
Целью работы является разработка методов синтеза новых флуоресцентных олигонуклеотидных зоднов для ЛЦР и разработка на их основе, новых методов детекции ДНК и РНК при помощи ЛЦР в режиме реального времени. В задачи исследования входило:
1. Разработать новый вариант ЛЦР-РВ, основанный на детекции результатов за счет свечения специфичного к двуцепочечной ДНК красителя SYBR Green I: 2. Разработать новые олигонуклеотидные зонды, на базе полициклических ароматических • флуорофоров пирена и перилена, чувствительных к молекулярному микроокружению и основанных на эффектах эксимерной флуоресценции и изменения анизотропии флуоресценции.
3. Разработать новые схемы детекции продуктов ЛЦР-РВ, основанные на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).
4. Оптимизировать условия проведения новых разработанных вариантов ЛЦР-РВ в отношении количества реагентов, состава реакционных смесей, времени и температуры реакций, используемых ферментов.
5. Испытать новые варианты ЛЦР-РВ для решения ряда актуальных практических задач в области молекулярной биологии.
Научная новизна работы заключается в следующем: Разработан дизайн и проведён синтез новых флуоресцентных олигонуклеотидных зондов для ЛЦР. Разработаны новые методы детекции ДНК и РНК при помощи ЛЦР-РВ. Показана возможность эффективной детекции следовых количеств ДНК и РНК с использованием новых методов флуоресцентной детекции в растворе. Предложены оптимальные системы детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени, которые далее применены для решения практически важных задач в молекулярно-биологических исследованиях и при анализе продуктов с генетически-модифицированными компонентами.
В результате проведенных исследований показана возможность эффективной детекции следовых количеств ДНК и РНК с использованием новых методов флуорецсентной детекции в растворе. Всего синтезировано более 20 различных олигонуклеотидных зондов для ЛЦР. Были обнаружены оптимальные системы детекции, которые были применены для решения практически важных задач в сфере детекции специфичных фрагментов ДНК в молекулярно-генетических исследованиях и при анализе продуктов с генетически-модифицированными компонентами. Результаты настоящего исследования могут быть использованы при проведении ДНК-диагностики в медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях, криминалистике, пищевой промышленности для обнаружения возбудителей опасных инфекций, генетической идентификации личности, выявления продуктов питания из генетически модифицированных организмов, определения качества сырья и т.д.
По материалам данной диссертации опубликовано 5 научных статьей (в том числе в журналах из перечня ВАК — 4), 3 заявки на патент (одна международная и две российских) и 8 тезисов докладов научных конференций. Результаты работы были доложены на научной сессии к 100-летию со дня рождения проф. Н.А. Преображенского (Москва, 21-22 октября 1996), Российском съезде медицинских генетиков (Курск, 17-19 мая 2000 г.), конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоёмким технологиям» (Пущино, 24-26 октября 2001), третьем съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва. 6-12 июня 2004), втором съезде Общества биотехнологов России (Москва 2004), третьем съезде Общества биотехнологов России (Москва 2005), международном конгрессе «Тенденции в химии нуклеиновых кислот» (Москва, 20-26 ноября 2000), международном симпозиуме «Трансгенные растения и проблемы биобезопасности» (Москва 2004), 2-ой международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда" (Пущино, 10-13 мая 2005).