Кальций-транспортирующие системы мембран саркоплазматического ретикулума Молекулярные механизмы регуляции активности
Диссертация
Автор: Рубцов, Александр Михайлович
Название: Кальций-транспортирующие системы мембран саркоплазматического ретикулума Молекулярные механизмы регуляции активности
Справка: Рубцов, Александр Михайлович. Кальций-транспортирующие системы мембран саркоплазматического ретикулума Молекулярные механизмы регуляции активности : Дис. д-ра биол. наук : 03.00.04 Москва, 2003 c. :
Объем: стр.
Информация: Москва, 2003
Содержание:
стр
II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1 Строение и функции саркоплазматического ретикулума
11 Общие аспекты
12 Са-связывающие белки саркоплазматического ретикулума
Глава 2 Са-каналы (рианодиновые рецепторы) саркоплазматического ретикулума
21 Виды внутриклеточных Са-каналов
22 Идентификация и выделение Са-каналов СР (рианодиновых рецепторов)
23 Структура Са-каналов саркоплазматического ретикулума
24 Проводимость Са-каналов СР для одновалентных и двухвалентных катионов
25 Изоформы рианодинового рецептора и особенности электромеханического сопряжения в разных типах мышц
26 Взаимодействие рианодинового рецептора с белками саркоплазматического ретикулума
27 Регуляция активности Са-каналов СР эндогенными и экзогенными соединениями
28 Участие протеинкиназ в регуляции функциональной активности рианодинового рецептора
29 Возможные механизмы нарушения работы Са-каналов при мышечном утомлении
Глава 3 Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума
31 Молекулярная организация Са-АТФазы
32 Механизм функционирования Са-АТФазы
33 Регуляция активности Са-АТФазы
34 Олигомерная организация Са-АТФазы в мембранах СР
Глава 4 Гистидинсодержащие дипептиды и их возможные физиологические функции rv
41 Участие карнозина в процессах мышечного сокращения
42 Буферные свойства карнозина
Глава 5 Использование мелиттина для исследования биологических мембран и мембранных ион-транспортирующих АТФаз Р-типа
51 Структура молекулы мелиттина
52 Взаимодействие мелиттина с мембранами и мембранными ферментами
53 Мелиттин-подобные белки
Глава 6 Гибернация млекопитающих
61 Общие аспекты
62 Особенности энергетического обмена в сердце и скелетных мышцах при гибернации
63 Адаптационные изменения сократительных белков при гибернации
6А Изменения метаболизма Са в сердце и скелетных мышцах при гибернации ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Ш МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
III 1 ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ
11 Выделение препаратов легкого саркоплазматического ретикулума
12 Выделение препаратов тяжелого саркоплазматического ретикулума из скелетных мышц
13 Выделение препаратов тяжелого саркоплазматического ретикулума из сердца утки
14 Получение мембранных и цитозольных фракций из слизистой оболочки желудка и скелетных мышц кролика
15 Получение липосом и протеолипосом с различным содержанием белка Са-АТФазы в мембране V
16 Иммунизация кроликов мелитгином и получение антимелиттиновых антител
17 Выделение мелитган-подобного белка методом аффинной хроматографии
18 Получение имидазольной соли АТФ и ГТФ
19 Получение декаванадата и Е2-кристаллов Са-АТФазы
III2 АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
21 Определение концентрации белка по методу Лоури
22 Определение концентрации белка по методу Спектора
23 Определение количества фосфолипидов по неорганическому фосфору
24 Электрофорез в полиакриламидном геле
25 Определение активности Са-АТФазы с использованием системы сопряженных ферментативных реакций
26 Определение активности Са-АТФазы по нарастанию неорганического фосфата
27 Определение активности Са-АТФазы методом непрерывной регистрации рН в слабозабуференной среде
28 Определение пара-нитрофенилфосфатазной активности Са-АТФазы
29 Регистрация АТФ-зависимой аккумуляции Са и лигандиндуцируемого выброса Са^ ^
210 Регистрация выхода Са из пассивно нагруженных везикул СР с использованием "^ С^а^ "^
211 Ингибирование активности Са-АТФазы мелитгином
212 Температурная обработка мембран саркоплазматического ретикулума
213 Определение количества SH-rpynn и их кинетических параметров с помощью НБД-хлорида VI
214 Анализ инактивации Са-АТФазы препаратов СР НБД-хлоридом
215 Определение значений кажущихся Кд для нуклеотидов, обеспечивающих защиту Са-АТФазы от инактивации НБД-хлоридом
216 Получение НБД-меченых препаратов Са-АТФазы для флуоресцентных исследований
217 Электронная микроскопия
218 Включение ФИТЦ, ЭИТЦ и Р1АЭ в Са-АТФазу
219 Регастрация анизотропии фосфоресценции меченых ЭИТЦ и ИАЭ препаратов Са-АТФазы
220 Регастрация генерации вторых гармоник поверхностью мембран СР
221 Исследование свойств липидной фазы мембран саркоплазматического ретикулума с использованием флуоресцентных зондов
222 Анализ тушения собственной флуоресценции Са-АТФазы гидрофобными и гидрофильными соединениями
223 Исследование структурного состояния липидной фазы мембран методом ЭПР
224 Анализ гидроксил-радикал связывающей способности карнозина и родственных ему соединений с использованием метода спиновых ловушек
225 Измерение поверхностного потенциала мембран СР с помощью рН-чувствительного индикатора нейтрального красного
226 Определение титра сыворотки с помощью твердофазного иммуноферментного анализа
227 Иммуноблоттинг
228 Анализ олигомеризации белка Са-АТФазы в присутствии офенантролина и ионов меди VII
229 Определение уровня включения фосфата в белки саркоплазматического ретикулума
230 Авторадиография ШЗ ЖИВОТНЫЕ
1114 МАТЕРИАЛЫ
1115 МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1 Характеристика используемых в работе препаратов тяжелого саркоплазматического ретикулума и методических подходов для исследования выхода Са^ "^
Глава 2 Влияние производных 1,4-дигидропиридина на свойства Са-каналов рети1^лума
Глава 3 Характеристика Са^ -^ и кофеин-индуцируемого выброса Са^ ^ из препаратов тяжелого СР и поиск кофеинсвязывающих белков
Глава 4 Регуляция Са-каналов СР карнозином и родственными соединениями
41 Активация Са-каналов гистидинсодержащими соединениями
42 Влияние карнозина на взаимодействие Са-каналов с регуляторами их функциональной активности
43 Гидроксилрадикал-связывающая активность карнозина
Глава 5 Анализ нуклеотидсвязывающих свойств Са-каналов и альтернативные пути выхода Са^ ^ из везикул саркоплазматического ретикулума
Глава 6 Анализ нуклеотид-связывающих свойств Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума и влияние лигандов на конформационное состояние молекулы фермента
61 Химическая модификация SH-rpynn Са-АТФазы НБД-хлоридом
62 Защита адениловыми нуклеотидами Са-АТФазы СР от инактивации НБД-хлоридом
63 Анализ флуоресценции НБД-меченой Са-АТФазы VIII
64 Генерация вторых гармоник мембранными препаратами СР
65 Гидролиз разных субстратов Са-АТФазой СР
Глава 7 Олигомерная организация Са-АТФазы в мембранах СР
71 Электронная микроскопия
72 Сшивающие агенты
73 Анизотропия фосфоресценции
Глава 8 Влияние агрегации Са-АТФазы в мембранах ретикулума на активность фермента
81 Терморазобщение Са-насоса
82 Агрегация Са-АТФазы, индуцируемая мелиттином
Глава 9 Мелиттин как инструмент для исследования Са-АТФазы
91 Взаимодействие мелиттина с мембранами СР
92 Особенности ингибирования Са-АТФазы СР мелиттином
93 Влияние АТФ и ГТФ на ингибирование Са-АТФазы мелитгином
94 Ингибирование Са-АТФазы мелиттином при низких концентрациях АТФ в среде измерения активности
95 Ингибирование мелиттином гидролиза пНФФ Са-АТФазой СР
96 Ингибирование мелитгином солюбилизированной С12Е9 Са-АТФазы и термообработанного и обработанного глицерином препаратов СР
97 Идентификация мелиттин-подобных белков в разных тканях кролика
98 Очистка мелиттин-подобного белка и его влияние на активность Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума
Глава 10 Регуляция активности Са-АТФазы СР при гибернации сусликов Spermophiliis undulatus
101 Сравнительная характеристика препаратов СР скелетных мышц сусликов, крыс и кроликов
102 Сезонные изменения белкового состава мембран СР сусликов
103 Сезонные изменения активности Са-АТФазы СР скелетных мышц сусликов
104 Роль протеинкиназ в сезонной регуляции активности Са-АТФазы СР скелетных мышц суслика S undulatus IX
Введение:
Поддержание низкой концентрации Са^ ^ в цитоплазме клеток разных типов обеспечивается работой специальных мембранных ферментов - Са-АТФаз или Санасосов плазматической мембраны и сарко(эндо)плазматического ретикулума, которые способны переносить через мембрану 2 иона Са^ * против градиента его концентрации за счет гидролиза 1 молекулы АТФ, а также работой системы электрогенного Na/Ca-обмена. В некоторых случаях, особенно при развитии патологических состояний, в удалении Са^ ^ из цитоплазмы могут принимать участие м1похондрии, Са-АТФаза плазматических мембран относится к обширному семейству ионтранспортирующих АТФаз Р-типа (или Е1-Е2-типа), к которому относятся также Ыа,К-АТФаза плазматических мембран клеток животных, Н,К-АТФаза слизистой оболочки желудка, Са-АТФаза сарко(эндо)плазматического ретикулума, Н-АТФазы грибов и растений, а также некоторые АТФазы бактерий (Carafoli, 1991; МоПег et al, 1996). Все ион-транспортирующие АТФазы Р-типа в процессе гидролиза АТФ подвергаются циклическому фосфорилированию-дефосфорилированию по остатку аспарагиновой кислоты в активном центре фермента с образованием ацилфосфата.Кроме этого, характерной особенностью АТФаз Р-типа является наличие двух основных конформаций фермента, Е1 и Е2, которые различаются по сродству к переносимым ионам и последовательно сменяют друг друга.Са-АТФаза плазматических мембран состоит из одной полипептидной цепи и представлена 4 изоформами, РМСА1 - РМСА4 (аббревиатура "plasma membrane calcium-transporting ATPase"). Каждая изоформа РМСА кодируется своим геном, причем продукты каждого гена могут подвергаться альтернативному сплайсингу (например, известно по крайней мере 5 вариантов альтернативного сплайсинга для изоформы РМСА1 и 4 варианта для изоформы РМСА2). Таким образом, общее число различных форм фермента не менее 12. Наиболее широко распространены в разных тканях изоформы РМСА1 и РМСА4, изоформа РМСА2 обнаружена в нервных клетках, а изоформа РМСАЗ - в клетках мозга и скелетной мускулатуры.Разные изоформы РМСА состоят из 1080-1220 аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу 120-140 кДа (Carafoli, 1991).Как и большинство АТФаз Р-типа, молекула РМСА имеет в своем составе 10 трансмембранных а-спиральных участков, а ее N- и С-концевые участки находятся в цитоплазме. Активный центр фермента (участки связывания АТФ и фосфорилирования) расположен в большой цитоплазматической петле между 4 и 5 трансмембранными сегментами. Активность фермента может стимулироваться кислыми фосфолипидами (в первую очередь различными фосфоинозитидами). кальмодулином (СаМ) и, по-видимому, фосфорилированием РМСА цАМФзависимой протеинкиназой (ПКА). Участок связывания кислых фосфолипидов расположен в N-концевой части молекулы РМСА, а СаМ-связывающий центр и участок фосфорилирования ПКА локализованы в длинной С-концевой части молекулы. Именно эти участки в молекуле фермента наиболее вариабельны, что приводит к различной чувствительности разных изоформ РМСА к эндогенным регуляторам.РМСА активируется низкими концентрациями Са^ * (Кд для Са^ "^ в отсутствие СаМ составляет 1 цМ). Взаимодействие с ферментом СаМ приводит к увеличению сродства к Са в 5-10 раз и к увеличению максимальной скорости фермента в 2-4 раза. Предполагается, что С-концевой СаМ-связывающий участок РМСА выполняет роль "внутримолекулярного ингибитора", который связывается с активным центром фермента, ингибируя его. Связывание с этим участком СаМ в присутствии Са снимает это ингибирование и вызывает активацию фермента.Предполагается также, что определенную роль в снятии ингибирования играет и связывание ионов Са^ "^ с отрицательно заряженными аминокислотными остатками С-концевого участка. Таким образом, в ответ на увеличение внутриклеточной концентрации Са^ ^ активность РМСА возрастает, что приводит к ускорению удаления Са из клетки и ее переходу в состояние покоя (Carafoli, 1991).Молекула Ка,Са-обменника пронизывает мембрану 11 раз, ее N-конец экспонирован во внеклеточное пространство и способен гликозилироваться, а Сконец расположен в цитоплазме. Большой цитоплазматический домен, расположенный между 5 и 6 трансмембранными а-спиральными сегментами, содержит участок связывания СаМ и регуляторный Са-связывающий центр.Расположение участков связывания транспортируемых через мембрану ионов Са^ * и Na"*" пока не установлено. По-видимому, они расположены в трансмембранных сегментах, поскольку полная делеция цитоплазматического домена приводит к* потере только 50% транспортной активности обменника (Orlov et al., 1995).Са-АТФаза внутриклеточных органелл или SERCA (аббревиатура "sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium-transporting ATPase") также представлена в разных тканях несколькими изоформами: SERCA1 обнаружена в быстрых скелетных мышцах, SERCA2a - в сердце, медленных скелетных и гладких мышцах, SERCA2b - в разных типах клеток и SERCA3 - в клетках крови и во многих эндотелиальных и эпителиальных клетках (Pozzan et al., 1994; Moller et al., 1996). Фермент состоит из 994-1042 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 110-115 кДа.Как и РМСА, SERCA переносит через мембрану внутрь полостей ретикулума 2 иона Са за счет гидролиза 1 молекулы АТФ. Молекула фермента также имеет 10 трансмембранных а-спиральных сегментов и большой цитоплазматический домен, содержащий АТФ-связывающий центр и участок фосфорилирования. В отличие от РМСА, С-концевой участок SERCA короткий и не содержит участка связывания СаМ, т.е. активность этого фермента СаМ прямо не регулируется. Однако СаМзависимые пути регуляции активности некоторых изоформ SERCA существуют и мы познакомимся с ними далее более подробно.В цитоплазму клеток Са поступает либо из окружающей среды через специфические Са-каналы плазматической мембраны, либо из внутриклеточных Са-депо - различных компартментов эндоплазматического ретикулума и кальцисом, мембраны которых также содержат специфические Са-каналы. Структура и особенности функционирования и регуляции этих каналов очень разнообразны и пока не до конца выяснены, хотя некоторые Са-каналы охарактеризованы достаточно хорошо.Са-каналы плазматических мембран можно условно разделить на 4 группы: потенциалчувствительные Са-каналы, активирующиеся при деполяризации мембраны, рецепторуправляемые Са-каналы, Са-каналы, активируемые вторичными посредниками, и Са-каналы, активируемые G-белками (Авдонин, Ткачук, 1994). Хорошо изучены представители первой группы Са-каналов, тогда как представители остальных трех групп зарегистрированы, главным образом, в электрофизиологических экспериментах, поэтому их молекулярная организация практически неизвестна.Потенциалчувствительные Са-каналы обнаружены во всех электровозбудимых тканях и, в свою очередь, также разделяются на несколько типов по кинетическим свойствам и чувствительности к мембранному потенциалу, агонистам и антагонистам. Са-каналы L-типа представляют собой гетероолигомеры и состоят из 5 разных типов субъединиц: a l (155-200 кДа), а2 (130-150 кДа), которая ковалентно связана с 5-субъединицей (24-33 кДа) S-S-мостиками, р (52-56 кДа) и у (30-33 кДа). Са-пору формирует а 1-субъединица, она же является сенсором напряжения и связывает дигидропиридины (нифедипин, нитрендипин), фенилалкиламины (верапамил, D600) и бензотиазепины (дилтиазем). Эта субъединица состоит из четырех гомологичных трансмембранных доменов (I-IV), каждый из которых представлен шестью а-спиральными сегментами. В каждом домене четвертый трансмембранный сегмент обогащен остатками Lys и Arg (каждая третья аминокислота) и заряжен положительно. Именно эти сегменты и являются "сенсорами напряжения": при изменении мембранного потенциала они перемещаются в направлении, перпендикулярном плоскости мембраны, и индуцируют изменение конформации молекулы Са-канала, которое приводит к его открыванию. Проводящая Са пора образована, вероятно, четырьмя мембранными петлями, расположенными между 5 и 6 а-спиральными сегментами в каждом трансмембранном домене молекулы канала. Интересно отметить, что практически идентичную а 1-субъединице Са-канала структуру имеет потенциалчувствительный Na-канал, а потенциалчувствительный К-канал состоит из 4 субъединиц, каждая из которых содержит 6 трансмембранных а-спиральных сегментов.К рецепторуправляемым Са-каналам можно отнести никотиновый холинорецептор (Na-канал), который помимо Na^ может переносить и Са^* (его селективность к Са^"*^ всего в 3-5 раз ниже, чем к одновалентным катионам), а также Са-каналы, управляемые подклассом глутаматных рецепторов - NMDAрецепторами, и Рг-пуринорецепторами, активируемыми АТФ и АДФ. К активируемым вторичными посредниками каналам относят Са-каналы плазматической мембраны, активируемые инозитол-1,4,5-трисфосфатом (1пзРз), инозрггол-1,3,4,5-тетракисфосфатом, ионами Са и циклическими нуклеотидами (цАМФ и цГМФ). Имеются также многочисленные данные о существовании Саканалов, управляемых через G-белки, а также каналов, которые открываются после опустошения внутриклеточных Са-депо (Авдонин, Ткачук, 1994; Ткачук, 1998).Однако, как отмечалось выше, эти каналы были зарегистрированы в электрофизиологических экспериментах; особенности их молекулярной организации и регуляции изучены пока недостаточно.К Са-каналам внутриклеточных органелл относят так называемые рианодиновые рецепторы (RyR) и рецепторы инозитол-1,4,5-трисфосфата (InsPsR), встроенные в мембраны разных компартментов эндоплазматического ретикулума и кальцисом (Berridge, 1993; Ogawa et al., 1999). Рианодиновые рецепторы найдены к настоящему времени у млекопитающих в скелетных мышцах (изоформа RyRl), сердце (изоформа RyR2), а также в мозге, почках, печени, поджелудочной железе, тонком и толстом кишечнике и во многих других тканях (изоформа RyR3). Разные изоформы RyR состоят из 4872-5037 аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу 550-560 кДа. Кроме того, известно, что функциональный Саканал представляет собой гомотетрамер. Предполагается, что N-концевая часть молекулы RyR формирует большой цитоплазматический домен, а на С-конце расположено несколько трансмембранных а-спиральных сегментов (от 4 до 10-12), формирующих Са-пору. Са-каналы RyR активируются низкими (микромолярными) и ингибируются высокими (миллимолярными) концентрациями С а , активируются адениловыми нуклеотидами и кофеином, а также за счет взаимодействия RyR с Сасвязывающими белками S-100A и аннексином VI.Практически во всех типах клеток обнаружены InsPsR (как минимум 5 изоформ, являющихся как продуктами разных генов, так и образующихся в результате альтернативного сплайсинга). Молекулярная масса InsPsR примерно вдвое меньше, чем RyR (260-280 кДа, 2701-2749 аминокислотных остатков), однако его структура близка к таковой RyR. InsPsR также представляет собой гомотетрамер. Большой N-концевой цитоплазматический домен содержит участок связывания InsPs, а С-конец содержит трансмембранные а-спиральные участки и формирует Са-пору (Berridge, 1993). В отличие от RyR InsPsR ингибируется гепарином и не активируется кофеином. По-видимому, RyR и InsPsR локализованы в разных внутриклеточных Са-депо, между которыми возможен обмен Са^ "^ .ХпзРз образуется из фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата под действием специфической к фосфоинозитидам фосфолипазы Этот фермент активируется либо G-белками, либо за счет фосфорилирования протеинкиназами при активации целого ряда рецепторов плазматической мембраны: некоторых мускариновых холинорецепторов, Рг-пуриноцецепторов, Вг-рецепторов брадикинина, гастриновых, холецистокининовых, гистаминовых, серотониновых рецепторов, рецепторов вазопрессина, ангиотензина II, эпидермального фактора роста и других (Авдонин, Ткачук, 1994). Вторым продуктом фосфолипазы С является диацилглицерол - известный активатор протеинкиназы Итак, легко видеть, что Са-каналы и Са-АТФаза сарко(эндо)плазматического ретикулума широко распространены и играют важную роль в обмене кальция в разных тканях. В мускулатуре разных типов, функциональная активность которой регулируется циклическими изменениями уровня Са в цитоплазме, именно этим мембранным системам принадлежит ключевая роль в регуляции процессов сокращения и расслабления. Поскольку настоящая работа посвящена исследованию некоторых особенностей регуляции этих систем, а именно Са-каналов (рианодиновых рецепторов) и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц, познакомимся с ними более подробно.