Главная » 2014 » Сентябрь » 24 » Скачать Изучение элементов скрытого метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот. Сычева, бесплатно
9:34 PM
Скачать Изучение элементов скрытого метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот. Сычева, бесплатно
Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот
Диссертация
Автор: Сычева, Елена Викторовна
Название: Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот
Справка: Сычева, Елена Викторовна. Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.03 / Сычева Елена Викторовна; [Место защиты: Гос. науч.-исслед. ин-т генетики и селекции промышленных микроорганизмов] Москва, 2008 124 c. : 61 08-3/51
Объем: 124 стр.
Информация: Москва, 2008
Содержание:
1 ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Глава
I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 "Скрытый" метаболизм
12 Примеры реакций "скрытого" метаболизма
13 Синтез неканонических аминокислот в пути биосинтеза лейцина
14 Механизм токсического действия норлейцина
15 Получение аналогов белков, содержащих неканонические аминокислоты
16 Пути метаболизма треонина в клетках coli
17 Биосинтетическая треониндезаминаза
18 Аэробные пути деградации треонина
19 Анаэробный путь деградации треонина
110 Регуляция транскрипции tdcABCDEFG оперона
111 ТРР-зависимый путь деградации треонина
112 Метилцитратный цикл метаболизма пропионил-КоА
113 Синтазы ацетогидроксикислот в синтезе разветвленных аминокислот у Е coli
114 Классификация синтаз ацетогидроксикислот и их метаболическая роль
115 Изоферменты AHAS у Е coli
116 Субстратная специфичность и кинетические свойства AHAS
117 Регуляция экспрессии AHAS
118 Регуляция транскрипции ilvBN оперона
119 Регуляция транскрипции ilvGMEDA оперона
120 Регуляция транскрипции ilvIHоперона
Глава
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Среды, условия культивирования штаммов
22 Трансформация, трансдукция бактерий, интеграция экспрессионных кассет линейных фрагментов ДНК
23 Бактериальные штаммы, использованные в данной работе
24 Эксперименты с рекомбинантной ДНК И
25 Хромосомные модификации с использованием ARed-зависимой системы интеграции
26 Конструирование рекомбинантных плазмид
27 Условия измерения методами ТСХ и ГЖХ
28 Анализ деградации Ь-[и- С]треонина в штамме ITP
29 Получение Ь- С-треонина
210 Регистрация и обработка ЯМР-спектров
211 Измерение энзиматических активностей
212 Определение активности треониндезаминазы
213 Определение активности ацетолактатсинтазы
214 Определение активности изопропилмалатсинтазы
215 Определение времени полужизни треониндезаминазы и AHAS
216 Идентификация и анализ накопления норвалина и норлейцина
217 Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) аминокислот
218 Анализ образования норвалина и норлейцина покоящимися клетками Е coli
219 Компьютерные программы, использованные в данной работе
Глава
III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
31 Изучение аэробной деградации треонина в модельном штамме 1ТР290-3 в условиях контролируемой экспрессии треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированию
32 Конструирование модельного штамма ITP
33 Изучение конверсии треонина в изолейцин в модельном штамме 1ТР290-3 в условиях контролируемой экспрессии гена ilvA е
34 Анализ продуктов деградации Ь-[и- С]треонина в штамме ITP
35 Анализ продуктов деградации Ь-13С-треонина методом ЯМР-спектроскопии
36 Изучение ферментов пути аэробного метаболизма треонина в пропионат
37 Влияние амплификации и инактивации генарохВ на синтез пропионата в штамме ITP
38 Влияние инактивации гена асеЕ на синтез пропионата в штамме ITP
39 Изучение возможного метаболизма пропионил-КоА в метилцитратном цикле
310 Модификация экспрессии AHAS ключевых ферментов биосинтеза разветвленных аминокислот
311 Клонирование генов AHAS II под контролем регуляторной области ilvBN оперона
312 Клонирование генов валин-чувствительных AHAS I и AHAS III
313 Клонирование генов AHAS I в составе оперона P]hTA-Aatt-lhrA442B
314 Клонирование генов AHAS и з М methylotrophus
315 Изучение сверхсинтеза норвалина и норлейцина в пути биосинтеза лейцина у штамма Е coli, дефектного по AHAS
316 Сверхсинтез норвалина и норлейцина штаммом B7AilvBNAilvGMAilvIH
317 Подтверждение предполагаемого пути биосинтеза норвалина и норлейцина
318 3 Образование норвалина и норлейцина покоящимися клетками Е coli с разным уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина
319 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей IPMS
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Введение:
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Всем ферментам в той или иной степени присуще наличие альтернативных субстратов. Именно это свойство определяет гибкость метаболических путей и обеспечивает замечательную приспособляемость микроорганизмов к изменяющимся условиям роста. Зачастую в новых условиях могут возникать целые альтернативные метаболические пути, так называемые пути "скрытого" метаболизма, которые обусловливают способность клеток к утилизации новых источников питания или к катаболизму токсичных агентов экзогенного или эндогенного происхождения [1]. Изучение таких путей становится особенно актуальным при создании на основе микроорганизмов штаммов-продуцентов различных метаболитов, в частности, аминокислот. Стандартным подходом в такой работе является усиление метаболических потоков, приводящих к синтезу целевого продукта, и блокирование "ненужных" путей. Это достигается путем увеличения или уменьшения экспрессии соответствующих генов, что может приводить к внутриклеточному накоплению интермедиатов биосинтеза. В результате чего могут включаться "скрытые" метаболические пути, катаболизирующие эти интермедиаты, причем соответствующие метаболические потоки могут быть весьма значительными, что может отрицательно сказаться на выходе целевого продукта и приводить к накоплению примесей. Мы столкнулись с явлением "скрытого" метаболизма при конструировании на основе Escherichia coli штамма-продуцента изолейцина. Известно, что изолейцин образуется из треонина (Рис. 1.1), поэтому при создании штамма-продуцента изолейцина необходимо в первую очередь усилить биосинтез треонина и блокировать его деградацию. Кроме того, для эффективной конверсии треонина в изолейцин очень важно подобрать оптимальный уровень экспрессии ключевых ферментов биосинтеза изолейцина биосинтетической треониндезаминазы (IlvA), осуществляющей превращение треонина в 2-кетобутират, и синтаз ацетогидроксикислот (AHAS), которые катализируют конденсацию 2-кетобутирата с пируватом с образованием 2-ацето-2-гидроксибутирата предшественника изолейцина. При создании штамма-продуцента изолейцина мы обнаружили, что усиление синтеза треонина в ряде случаев приводило к резкому снижению уровня синтеза изолейцина и накоплению в среде значительного количества пропионата. Мы предположили, что это явление связано главным образом с деградацией треонина, поэтому основной задачей работы стало изучение ранее неизвестных путей аэробной деградации треонина. транспорт из клетки включение в белки 2-амино3-кетобутират КоА КЫ Tdh TdcB —р>—s-— L-треонин НАДН НАД+ ДН НАД —-?—-v—* 2-кетобутират NH, рпв NH3 рпп V К о А Ч ацетил-КоА IlvA NH3 Ьнсоон КоА сЕ анаэробные условия L-глицин 2-кетобутират пируват пропионил-КоА Рн AHAS |со2 2-ацето-2-гидроксибутират Pta i/KoA пропионилфосфат AckA V TdcD V А Д Ф L-изолейцин Рис. 1.1. Метаболизм L-треонина в Е. coli Tdh треониндегидрогеназа, КЫ 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза, IlvA I I I АТФ пропионат треониндезаминаза (биосинтетическая), AHAS синтазы ацетогидроксикислот; TdcB треониндезаминаза (катаболитная), PflB пируватформиатлиаза, TdcE 2-кетобутиратформиатлиаза, Pta фосфотрансацетилаза, AckA, TdcD пропионаткиназы К настоящему времени в клетках Е. coli охарактеризованы два пути катаболизма треонина превращение треонина в глицин, в котором участвуют треониндегидрогеназа (Tdh) и 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза (КЫ) [2], и анаэробная деградация до пропионата [3] (Рис. 1.1). Показано, что на первом этапе анаэробного пути деградации треонин превращается в 2-кетобутират под действием биодеградативной треониндезаминазы (TdcB). Затем 2-кетобутират неокислительно декарбоксилируется с образованием чувствительны пропионил-КоА фомиатлиазами кетокислот PflB и TdcE, которые к кислороду и не активны в аэробных условиях. В дальнейшем превращении пропионил-КоА в пропионат через пропионилфосфат принимают участие фосфотрансацетилаза (Pta) и пропионаткиназы TdcD и AckA. Другие пути деградации треонина в клетках Е. coli к настоящему времени не охарактеризованы. 8 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ Данная работа является продолжением исследований, проводимых в ЗАО "АГРИ" и направленных на конструирование высокоэффективных штаммов-продуцентов треонина и изолейцина. Основной целью настоящей работы являлось изучение путей аэробного метаболизма треонина в клетках Е. coli, связанных с образованием 2-кетобутирата. В процессе работы решались следующие задачи: изучение путей аэробной деградации треонина в клетках Е. coli; идентификация ферментов, участвующих клетках Е. coli; создание коллекции генетических конструкций, несущих гены, кодирующие изоферменты синтаз ацетогидроксикислот (AHAS) из Е. coli и Methylophilis methylotrophus для дальнейшего применения при конструировании штаммовпродуцентов разветвленных аминокислот; исследование роли ферментов биосинтеза лейцина в образовании неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из 2-кетобутирата; изучение возможности сверхсинтеза норвалина и норлейцина в Е. coll в аэробной деградации треонина в НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ В настоящей работе изучена аэробная деградация L-треонина, однородно меченного изотопами 14 С и 13С, в модельном штамме Е. coli ITP290-3. Этот штамм накапливает экспрессии гена ilvA е кодирующего биосинтетическую к ретроингибированию, и изолейцин в условиях треонин в отсутствие IkR треониндезаминазу, устойчивую экспрессии гена ilvA Показано, что в клетках Е. coli в аэробных условиях происходит деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират в случае, когда треонин эффективно дезаминируется треониндезаминазой, устойчивой к ретроингибированию, с образованием 2-кетобутирата. Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата является незначительным. Создана коллекция экспрессионных кассет, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот Е. coli и М. methylotrophus. Получены варианты оперона ilvG603M и ilvBN Е. coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией. Полученные конструкции в дальнейшем могут применяться при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот. 9 Получен штамм Е. coli с делециями всех генов, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы с выходом 8%. На примере данного штамма подтвержден предполагаемый механизм образования норвалина и норлейцина в клетках Е. coli из 2-кетобутирата или пирувата ферментами пути биосинтеза лейцина. 10