Главная » 2014 » Август » 27 » Скачать Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) и её эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папилломы бесплатно
3:21 AM
Скачать Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) и её эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папилломы бесплатно
Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) и её эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папилломы человека 16 типа (HPV16)
Диссертация
Автор: Рыжакова, Ольга Сергеевна
Название: Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) и её эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папилломы человека 16 типа (HPV16)
Справка: Рыжакова, Ольга Сергеевна. Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) и её эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папилломы человека 16 типа (HPV16) : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.04 / Рыжакова Ольга Сергеевна; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т биомед. химии им. В.Н. Ореховича РАМН] Москва, 2008 104 c. : 61 08-3/795
Объем: 104 стр.
Информация: Москва, 2008
Содержание:
Оглавление2
Список сокращений
Введение6
Глава I Обзор литературы9
11 Общая характеристика ММП9
12 Структура ММП12
13 Характеристика основных подсемейств ММП17
131 Коллагеназы17
132 Желатиназы22
133 Стромелизины
134 Матрилизины24
135 Мембраносвязанные ММП25
136 Неклассифицированные ММП26
14 Регуляция активности ММП28
141 Регуляция транскрипции28
142 Активация про-ММП30
143 Эндогенные тканевые ингибиторы ММП (ТИМП)32
15 Роль ММП в опухолевой прогрессии33
151 ММР-1 или коллагеназа-1(интерстициальная коллагеназа) в прогрессии опухоли35
152 МТ1-ММР- мембраносвязанная ММП- в клеточной инвазии37
153 Роль коллагеназы —3 - ММР-13 в прогрессии опухоли40
154 ММР-8 - коллагеназа —2 (коллагеназа нейтрофилов) в прогрессии опухоли 41
16 Некоторые регуляторные функции ММП42
Глава П Материалы и методы исследования45
ПЛ Использованные материалы45
1111 Список использованных реактивов45
1112 Клеточные линии
Н13 Клинический материал
II2 Методы исследования48
1121 Одновременное выделение ДНК и РНК гуанидинизотиоцианатным методом48
1122 Реакция обратной транскрипции РНК49
1123 Исследование экспрессии генов50
II231 Полимеразная цепная реакция (RT-PCR)52
II232 Электрофорез в агарозном геле
1124 Определение коллагенолитической активности52
11241 Выделение коллагена из кожи крыс
11242 Определение концентрации коллагена по содержанию оксипролина
И243 Получение меченного флуоресцеинизотиоцианатом коллагена53
II244Определение коллагенолитической активности55
1125 Идентификация коллагеназ IV типа, с помощью метода зимографии
1126 Иммуногистохимическое исследование
Глава III Результаты исследования и их обсуждение58
Ш1 Сравнительное исследование экспрессии ММП-1 МТ1-ММП59
ТИМП-1 и уАП на модели фибробластов крысы
11111 Экспрессия генов ММП-1, МТ1-ММП, ТИМП-1 и уАП69
Ш12 Исследование коллагенолитической активности ММП62
Ш2 Сравнительное исследование экспрессии ММП-1 ММП-2 МТ1-ММП уАП ТИМП-12 в коммерческих клеточных линиях карцином шейки матки человека, ассоциированных с HPV-16 и HPV-18 68
Ш21 Экспрессия генов ММП-1, ММП-2, МТ1-ММП и эндогенных регуляторов их активности68
11122 Сравнительное исследование коллагенолитической активности72
ШЗ Исследование экспрессии ММП-1 МТ1-ММП ММП-2 ММПуАП ТИМП-1 ТИМП-2 в плоскоклеточных карциномах шейки матки,74
Ш31 Эспрессия генов ММП-1, МТ1-ММП, ММП-2, ММП-9, уАП, ТИМП-1 и ТИМП-2 в плоскоклеточных карциномах шейки матки75
Ш32 Исследование коллагенолитической активности77
11133 Исследование ММП-2, ММП-9 методом зимографии79
III34 Иммуногистохимическое исследование80
Выводы85
Список опубликованных работ по теме диссертации
Введение:
Матриксные металлопротеиназы или ММП относятся к семейству цинковых кальций-зависимых металлопротеиназ, функция которых связана с обменом белков соединительно-тканного матрикса (СТМ). Эти ферменты в совокупности способны гидролизовать все компоненты СТМ. ММП играют решающую роль в таких биологических процессах, как эмбриогенез, ремоделирование и репарация тканей, а также при развитии ряда патологических процессов, таких как ревматоидные артриты, остеоартриты, аневризмы аорты, периодонтиты, аутоимунные поражения кожи (1, 2) и т.д.
Особое место отводится ММП в развитии процессов инвазии и метастазирования опухолей. Тканевые коллагеназы (ММП-1, ММП-8, ММП-13), наряду с желатиназами (ММП-2, ММП-9), относятся к ММП и играют решающую роль в развитии этих процессов, поскольку они специфически гидролизуют белки группы коллагена — одного из основных компонентов СТМ. Коллагеназы, и в частности интерстициальная коллагеназа (ММП-1), специфически гидролизуют фибрилярные коллагены I, II, III, V и IX типов (2), которые составляют 25% от общего белка организма человека. Нативные фибриллярные коллагены устойчивы к действию протеолитических ферментов. ММП-1 специфически запускает гидролиз фибриллярных коллагенов, при этом она гидролизует всего одну связь в молекуле этого белка, находящуюся на расстоянии Ул длины молекулы от С-конца. Образующиеся фрагменты способны денатурировать в физиологических условиях и далее подвергаться действию широкого спектра протеиназ, тем самым ММП-1 обеспечивает развитие деструктивного процесса (2). Желатиназы гидролизуют коллаген IV типа -основу базальных мембран (3). Этим двум группам ферментов принадлежит ключевая роль в разрушении соединительно-тканного барьера при развитии инвазивного онкологического процесса.
В настоящее время интенсивно исследуются вопросы, связанные с экспрессией ММП при онкогенной трансформации. На клеточных системах показано влияние различных онкогенов на экспрессию ММП, однако вопросы связанные с эндогенной регуляцией активности этих ферментов исследованы недостаточно.
Нами было исследовано влияние гена Е7 вируса папиллом человека 16 типа (HPV16) на экспрессию ММП и их эндогенных регуляторов.
Вирусы папиллом (HPV) высокого риска - HPV16 и HPV18 являются этиологическими факторами возникновения рака шейки матки (4, 5, 6). Эти типы HPV являются наиболее агрессивными и широко распространенными. За открытие ключевой роли вируса HPV в возникновении рака шейки матки доктору Харольду цур Хаузену в 2008 году была присуждена Нобелевская премия. В настоящее время созданы вакцины против онкогенных вирусов папиллом человека, которые в ряде стран уже используются для предотвращения рака шейки матки. По статистическим данным в мире регистрируется до 500 тысяч новых случаев рака шейки матки, а женщины развивающихся стран подвержены этому заболеванию в 10 раз больше, чем остальные. Рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, по частоте заболеваемости и смертности от рака у женщин. Установлено, что основными трансформирующими генами вирусов папиллом человека являются гены Е6 и Е7 (4, 5, 6). У 90% больных раком шейки матки обнаруживаются транскрипты генов Е6 и Е7 в биопсийном материале. Однако функциональный потенциал генов Е6 и Е7 остается недостаточно изученным. Так недостаточно исследовано изменение протеолитического потенциала клеток и тканей, в частности интерстициальной коллагеназы, при трансформации их этим вирусом, что может служить важным маркером инвазивного процесса.
Настоящая работа является продолжением и частью исследований, проводимых в лаборатории биохимии и химической патологии белков ГУ НИИ БМХ РАМН и направленных на выяснение роли ММП в многоступенчатом процессе канцерогенеза. Целью настоящего исследования является выяснение особенностей экспрессии интерстициальной коллагеназы (ММП-1), эндогенных регуляторов ее активности, как факторов инвазии, при онкогенной трансформации фибробластов геном Е7 HPV16.
В соответствии с указанной целью поставлены следующие задачи:
1) Провести сравнительные исследования экспрессии ММП-1 , и эндогенных регуляторов её активности: тканевого ингибитора ММП - ТИМП-1 и активатора плазминогена уракиназного типа - уАП на фибробластах крысы, иммортализованных LT геном вируса полиомы и трансформированных геном Е7 HPV16. Исследования провести на уровне мРНК и белка.
2) На коммерческих клеточных линиях, полученных из опухолей шейки матки женщин: SiHa, Caski, Hela, С4-1, а также линии клеток СЗЗА, не содержащей копий HPV, провести сравнительные исследования экспрессии ММП-1, ММП-14 и ММП-2 ММП-9 (как двух групп ферментов, отвечающих за развитии инвазивного процесса), а также регуляторов их активности ТИМП-1, ТИМП-2 и у-АП на уровне мРНК и энзимологическом уровне.
3) Исследовать экспрессию ММП-1, ММП-2, ММП-9 и МТ1-ММП, а также ТИМП-1, ТИМП-2 и у-АП на операционных образцах плоскоклеточных карцином шейки матки, ассоциированных с геном Е7 HPV16 с использованием RT-PCR и методами иммуногистохимии и энзимологии.