Главная » 2014 » Июль » 21 » Скачать Гликопротеины gB и gD вируса болезни Ауески: взаимодействие с плазматическими мембранами клеток и роль в индукции противовирусного бесплатно
1:12 AM
Скачать Гликопротеины gB и gD вируса болезни Ауески: взаимодействие с плазматическими мембранами клеток и роль в индукции противовирусного бесплатно
Гликопротеины gB и gD вируса болезни Ауески: взаимодействие с плазматическими мембранами клеток и роль в индукции противовирусного иммунитета
Диссертация
Автор: Врублевская, Вероника Валерьевна
Название: Гликопротеины gB и gD вируса болезни Ауески: взаимодействие с плазматическими мембранами клеток и роль в индукции противовирусного иммунитета
Справка: Врублевская, Вероника Валерьевна. Гликопротеины gB и gD вируса болезни Ауески: взаимодействие с плазматическими мембранами клеток и роль в индукции противовирусного иммунитета : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.04 / Врублевская Вероника Валерьевна; [Место защиты: Ин-т биофизики клетки РАН] Пущино, 2007 157 c. : 61 07-3/1552
Объем: 157 стр.
Информация: Пущино, 2007
Содержание:
Оглавление
Список сокращений
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы
11 Общая характеристика болезни Ауески
12 Общая характеристика вируса болезни Ауески
13 Структурно-функциональная характеристика гликопротеинов gB и gD ВБА
131 Структурная характеристика гликопротеина gB ВБА
132 Структурная характеристика гликопротеина gD ВБА
133 Роль гликопротеинов gB и gD ВБА в проникновении вируса в клетки
1331 Первичное гепарансульфат-зависимое взаимодействие альфагерпесвирусов с клетками
1332 ГС-независимое связывание альфагерпесвирусов с клетками
1333 Слияние вирусной оболочки и плазматической клеточной мембраной
1334 Распространение альфагерпесвирусов от клетки к клетке
14 Роль гликопротеинов gB и gD ВБА в индукции противовирусного иммунитета
Введение:
Актуальность проблемы
Альфагерпесвирусы (семейство Herpesviridae, подсемейство Alphaherpesvirinae) включают в себя ряд опасных патогенов человека и животных (вирусы простого герпеса человека 1 и 2 типа, вирус ветрянки и опоясывающего лишая, вирус инфекционного ринотрахеита, вирус болезни Ауески и др.). В оболочке альфагерпесвирусов насчитывается более 10 гликопротеинов. В ряду других гликопротеинов, гликопротеины gD и gB альфагерпесвирусов занимают особое место. У отдельных альфагерпесвирусов гликопротеин gB, наряду с гликопротеином gC, играет важную роль в первичной гепарансульфат (ГС)-зависимой адсорбции вируса на клетках (Li et al., 1995; Byrne et al., 1995; Herold et al., 1994). Гликопротеин gD участвует в процессе формирования более стабильного, ГС-независимого связывания вирусов с плазматической клеточной мембраной, которое следует за первичной адсорбцией вируса (Reske et al., 2007; McClain and Fuller, 1994; Karger and Mettenleiter, 1993). К настоящему времени идентифицированы клеточные рецепторы гликопротеина gD (Spear, 2004; Spear and Longnecker, 2003). После стабильного связывания альфагерпесвирусов с клетками происходит слияние вирусной оболочки с плазматической клеточной мембраной. В данном процессе участвуют вирусные гликопротеины gB, gD и комплекс gH-gL (Campadelli-Fiume et al., 2007; Spear, 2004). Гликопротеин gK, а также ряд белков тегумента, играют модулирующую роль в этом процессе (Spear et al., 2000; Roizmanand Spear, 1996). Кроме того, gB альфагерпесвирусов необходим для распространения вируса от клетки к клетке (Nixdorf et al., 2000) и проявления синцитиального фенотипа вирусов (Navarro et al., 1992).
Несмотря на интенсивные исследования молекулярной биологии альфагерпесвирусов, механизмы взаимодействия гликопротеинов gB и gD с клетками остаются недостаточно исследованными. Имеются лишь фрагментарные данные, касающиеся клеточных белков, вовлеченных в процессы взаимодействия с гликопротеином gB альфагерпесвирусов, не определена роль клеточных белков в слиянии вирусной и клеточной мембран. Изучение взаимодействия gB и gD альфагерпесвирусов с клеточными рецепторными структурами представляет не только значительный теоретический интерес, но и может явиться основой для разработки противовирусных препаратов, так как блокирование взаимодействия клеточных рецепторов и вирусных антирецепторов представляется перспективным направлением в создании средств защиты от вирусных инфекций.
Кроме центральной роли гликопротеинов gB и gD альфагерпесвирусов в проникновении вирусов в клетки, эти гликопротеины так же играют важнейшую роль в индукции противовирусного иммунитета. Для многих альфагерпесвирусов показано, что гликопротеины gD и gB являются основными мишенями противовирусного иммунитета, индуцируя как гуморальный, так и клеточный иммунитет (Hong et al., 2002; van Rooij et al., 2000; Erratum, 2000; Packiarajah et al., 1998). В настоящее время гликопротеины gD и gB альфагерпесвирусов рассматриваются в качестве основных кандидатов на использование в вакцинах нового поколения (субъединичные вакцины, ДНК-вакцины).
Центральная роль гликопротеинов gB и gD альфагерпесвирусов в функционировании вирусов и в формировании противовирусного иммунитета определяет важность и актуальность дальнейшего исследования роли этих гликопротеинов на разных стадиях развития вирусов в клетках и в индукции противовирусного иммунитета.
Вирус болезни Ауески (ВБА, Suid herpesvirus 1), является типичным представителем альфагерпесвирусов и поражает многие виды диких и домашних животных (Wittman et al., 1991). Гликопротеины gB и gD ВБА характеризуются высоким уровнем структурной и функциональной гомологии с соответствующими гомологами других альфагерпесвирусов (Mettenleiter, 1994). Так, например, гликопротеин gB ВБА способен комплементировать gB-негативный мутант вируса простого герпеса человека 1-го типа; gB вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота способен комплементировать gB-негативный мутант ВБА (Miethke et al., 1995; Knopp and Mettenleiter, 1992; Rauh et al., 1991). Учитывая высокий уровень структурно-функциональной гомологии гликопротеинов gB и gD ВБА и других альфагерпесвирусов, ВБА является удобной моделью для изучения молекулярных механизмов взаимодействия гликопротеинов gB и gD альфагерпесвирусов с рецепторными структурами плазматических мембран чувствительных клеток, а также изучения их роли в индукции защитного иммунитета. Достоинством этой модели является апатогенность вируса для человека, легкость культивирования вируса на различных культурах клеток и наличие лабораторных моделей животных, чувствительных к вирусу (мыши, морские свинки, кролики).
Цель и задачи работы.
Целью работы было изучение взаимодействия гликопротеинов gB и gD вируса болезни Ауески с плазматическими мембранами чувствительных клеток и их роли в индукции противовирусного иммунитета.
Для достижения данной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Получить и охарактеризовать панель моноклональных антител к гликопротеинам gD и gB ВБА и разработать методы иммуноаффинной очистки гликопротеинов gD и gB.
2. Исследовать взаимодействие гликопротеинов gB и gD ВБА с плазматическими мембранами чувствительных клеток.
3. Реконструировать вирусные гликопротеины в мембраны искусственных липосом и исследовать с помощью полученных протеолипосом роль гликопротеина gB ВБА в адсорбции вируса на плазматические мембраны чувствительных клеток.
4. Исследовать антигенную структуру гликопротеина gD ВБА и индукцию гуморального иммунитета на этот гликопротеин при инфицировании и иммунизации животных.
5. Изучить роль гликопротеинов gD и gB ВБА в индукции противовирусного иммунитета с использованием очищенных гликопротеинов и реконструированных липосом.
Научная новизна работы
1. Впервые показано, что гликопротеин gB ВБА играет важную роль в адсорбции вируса на клетках.
2. Впервые доказано, что гепарансульфаты плазматических клеточных мембран играют центральную роль в связывании гликопротеина gB ВБА с клетками. Установлено, что гепарансульфат-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА является, по крайней мере, частично, конформационно-зависимым.
3. Впервые проведена реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны искусственных липосом. Полученные протеолипосомы (виросомы) специфически связывались с плазматическими клеточными мембранами и эффективно интернализовались клетками. С помощью виросом подтверждена важная роль гликопротеина gB ВБА в адсорбции вируса на клетках. Продемонстрировано, что виросомы на основе белков ВБА являются удобной моделью для изучения взаимодействия вирусных гликопротеинов с клетками и могут быть использованы для доставки биологически-активных молекул в клетки.
4. Впервые показано, что реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны искусственных липосом приводит к выраженному повышению их иммуногенности.
5. Установлено, что конформационные эпитопы гликопротеина gD ВБА играют центральную роль в индукции гуморального иммунного ответа на этот гликопротеин при инфицировании и иммунизации животных.
6. Показана высокая консервативность антигенной структуры гликопротеина gD ВБА.
Практическая значимость работы
1. Полученные в работе данные, касающиеся роли гликопротеинов ВБА в индукции противовирусного защитного иммунитета, а также иммуногенности липосомальных вирусных антигенов, могут лечь в основу разработки субъединичных и липосомальных вакцин против болезни Ауески.
2. Разработан иммуноферментный метод серологической диагностики болезни Ауески, основанный на выявлении в сыворотке животных антител к гликопротеину gD ВБА, который по своим характеристикам не уступает имеющимся тест-системам для диагностики болезни Ауески.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Гликопротеин gB вируса болезни Ауески играет важную роль в адсорбции вируса на клетках in vitro.
2. Гепарансульфаты плазматических клеточных мембран играют центральную роль в связывании гликопротеина gB ВБА с клетками. Гепарансульфат-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА является, по крайней мере, частично, конформационно-зависимым.
3. Гликопротеины gD и gB ВБА имеют различные сайты связывания на плазматической клеточной мембране. Клеточные гепарансульфаты не участвуют в связывании гликопротеина gD с клетками.
4. Конформационные эпитопы гликопротеина gD ВБА играют центральную роль в индукции гуморального иммунного ответа при инфицировании и иммунизации животных.
5. Гликопротеин gD ВБА играет важную роль в индукции защитного иммунитета при инфицировании и иммунизации животных.
6. Реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны липосом приводит к выраженному повышению их иммуногенности.